设计方案克隆基因[设计方案克隆基因怎么做]

　　ClonExpress ® 技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术，可将插入片段 PCR 产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段 PCR 引物 5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段 PCR产物 5’和 3’末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp ～ 20 bp)。这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在 Exnase ® 的催化下，仅需反应 30 min 即可进行转化，完成克隆。克隆阳性率可达 95% 以上。

　　ClonExpress II one step clone kit

　　ClonExpress ® II是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶Exnase ® II。和上一代产品相比，Exnase ® II中添加了独特的重组增强因子。一方面，这种增强因子可以显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞(10 7 cfu/μg)也可实现高效克隆(100 cfu/ng Vector)。另一方面，Exnase ® II还兼容常规酶切、PCR反应体系。克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR扩增产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。

　　实验流程

　　针对货号C112试剂盒的使用流程。 使用 ClonExpress ® II 进行基因克隆实验流程用于重组反应的克隆载体必须为线性化载体。该线性化载体可通过内切酶消化环状载体获得，也可由反向PCR扩增环状载体获得(图，上左)。插入片段由PCR扩增制备。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加线性化克隆载体末端序列(图中以红色和蓝色标记) 。使用该引物对扩增插入片段，扩增产物5’ 和 3’ 最末端的序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致(图，上右)。以线性化克隆载体和插入片段扩增产物配制重组反应体系，37℃反应30 min即可完成重组反应，实现两线状DNA 的体外环化(图，中)。重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选(图，下) 。

　　针对货号C113试剂盒的使用流程。 用于重组反应的克隆载体必须为线性化载体。该线性化载体可通过内切酶消化环状载体获得，也可由反向PCR扩增环状载体获得(图，上左)。插入片段由PCR扩增制备。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源重组序列(图中以深蓝色、深灰色、浅蓝色和红色标记)。使用这些引物分别扩增插入片段，扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的一致序列(图，上右)。以线性化克隆载体和插入片段扩增产物配制重组反应体系，37℃反应30 min即可完成重组反应，实现多片段顺序拼接并克隆至目标载体(图，中)。重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选(图，下)。

　　特点

　　广泛适用

　　设计简单

　　操作便捷

　　克隆高效

　　ClonExpress Entry

　　入门克隆 (Entry Cloning) 是分子生物学常规实验手段之一，特指将目标 DNA 无选择性的插入某个载体中，为后续测序鉴定、穿梭转移等实验创造便利条件。然而，常规的 TA 克隆技术由于无法直接克隆平末端产物、平末端产物加 A 步骤繁琐 / 克隆效率低、单碱基粘性末端连接效率低、T 载体易产生自连背景、大片段克隆效率极低、连接反应受 DNA 纯度影响大、连接产物具有双向性等诸多限制因素决定，该技术的适用性仍然是困扰很多研究者的棘手问题之一。为了彻底解决这些问题，Vazyme 的科学家创新性地将 ClonExpress ® 同源重组技术应用到了入门克隆实验中，成功的研发出了 ClonExpress ® EntryOne Step Cloning Kit。使用时，需在目标 DNA 扩增正反向引物 5’端各添加 15 bp 固定序列以实现扩增产物与试剂盒配套克隆载体末端的同源性。将目标 DNA 扩增产物和试剂盒配套载体混合后，仅需一步 30 min 反应即可直接进行转化，完成克隆。反应过程中，同源重组酶 Exnase ® Entry 会催化扩增产物和克隆载体的高效环化，效率可达 100 cfu/ng Vector，克隆阳性率可达 95% 以上。此外，ClonExpress ® Entry 反应体系兼容绝大多数 PCR 反应体系，即扩增产物可不进行任何处理直接进行重组反应。相对于 TA 克隆而言，ClonExpress ® Entry 一步法入门克隆技术具有适用性更广、效率更高、克隆长度更长、流程更简单等诸多优势。简单的思维转变，带来的却是全新的体验！

　　实验流程

　　设计插入片段扩增引物，在扩增正反向引物5’端分别添加URS (Upstream Recombination Sequence)和DRS (Downstream Recombination Sequence)。使用该对引物扩增插入片段(图，上左)。以CE Entry Vector和插入片段扩增产物进行重组反应，37℃反应30 min，实现两线状 DNA 的体外环化 (图，中)。重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选 (图，下) 。

　　特点

　　高度简化的实验流程

　　优异的克隆效率

　　出众的克隆阳性率

　　宽广的模板量兼容范围

　　广泛的体系兼容性

　　Mut Express

　　Mut Express ® 快速定点突变技术是基于 ClonExpress ® 快速克隆技术的定点突变系统。目标质粒扩增产物经 DpnI 消化、ClonEx-press ® 重组环化后直接转化即可完成定点突变。该系统由 Phanta ® Max 超保真酶扩增模块和 ClonExpress ® 快速克隆模块两部分组成。

　　Phanta ® Max 超高的保真度和卓越的长片段扩增能力，显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性，广泛适用于长度小于 40 kb 的任何质粒扩增；ClonExpress ® 利用高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应，进一步提高了定点突变实验的成功率。因此，使用Mut Express ® 定点突变试剂盒进行定点突变时，引物设计更加灵活，且扩增反应不再需要以线性方式进行，极大减少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的彻底降解。和上一代产品相比，新试剂盒中分别配有专门针对单 / 双位点定点突变和多位点定点突变而优化的重组酶 Exnase ® II 和 Exnase ® MultiS，且扩增产物经过 DpnI 消化后可不进行纯化而直接用于重组反应。高度优化的反应体系、快捷的操作流程以及惊人的定点突变效率，使得 Mut Express ® 成为定点突变首选试剂盒。

　　实验流程

　　针对货号C212试剂盒的使用流程。 以待突变位点A、B为界，将质粒分为AB段和BA段。在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物。以原始质粒为模板，分别扩增AB段 (A Forward Primer 和B Reverse Primer)和BA段 (A Reverse Primer 和B Forward Primer) (图，I)。扩增产物经DpnI消化 (图三，I)后，进行重组环化 (图，II)。重组产物直接进行转化即可完成双点突变 (图，III)。

　　针对货号C213试剂盒的使用流程。 以待突变位点A、B、C为界，将质粒分为AB、BC和CA三段。在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物。以原始质粒为模板，分别扩增AB段 (A Forward Primer 和B Reverse Primer)、BC段(B Forward Primer 和C Reverse Primer) 和CA段 (C Forward Primer 和A Reverse Primer) (图，I)。扩增产物经DpnI消化 (图一，I)后，进行重组环化 (图，II)。重组产物直接进行转化即可完成定点突变 (图，III)。

　　针对货号C214试剂盒的使用流程。 设计部分反向互补的引物，对原始质粒进行反向扩增(图一，I)。

　　扩增产物经DpnI消化(图一，I)后，进行重组环化(图一，II)。重组产物直接进行转化即可完成定点突变(图一，III)。

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